登陆一、简介
随着研究的进展,仅仅对细胞进行定量和活性的检测已不能满足需要。在单细胞水平研究细胞因子的表达能力对研究细胞因子在疾病中的作用越来越重要。目前检测单个细胞特定细胞因子的表达手段包括:多参数流式细胞术,ELISPOT、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析(limiting dilution analysis,LDA)和单细胞PCR,应用原位杂交技术和免疫组化方法观察细胞因子蛋白表达及mRNA表达可以识别Th1和Th2细胞,此方法可获得较强的细胞内信号,但此方法工作量大、主观性强,难以进行大样本检测,且人肉眼识别能力有很大的局限性,而ELISPOT及单细胞PCR技术,技术性强、劳动强度大,难以进行广泛推广。随着细胞表面标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现,使对胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。下面主要对胞内细胞因子流式细胞技术作以介绍。
因为自然状态下,T淋巴细胞产生少量的细胞因子,通常要对T淋巴细胞体外活化进行研究。在体外刺激过程中,T淋巴细胞产生的细胞因子已释放出来,胞内细胞因子信号较弱,难以进行检测。近来,采用PMA与 Ionomycin等药物刺激,用Brefeldin A (BFA)或者Monensin阻断胞内高尔基体介导的转运,使得细胞因子聚集和蓄积,以增强细胞因子信号可被流式细胞仪检测。
多参数流式细胞术可检测单个细胞内多个细胞因子,并可区分表达特定细胞因子的细胞亚群。该方法在细胞水平证明了人与鼠的淋巴细胞都存在1型与2型分化,且这些分化在特定细胞因子增强时可被逆转。且研究清楚地证明,只有激活的细胞亚群可以表达细胞因子,静止的正常淋巴细胞(T、B、NK)不分泌细胞因子。
胞内细胞因子流式分析法是用抗细胞因子抗体与细胞表面或胞内特定亚群标志物组合,即可检测不同细胞亚群细胞因子的分泌,同时采用特殊的化学试剂,荧光素与抗体选择,确保无细胞因子分泌细胞的最小荧光背景。具有其它方法难以比拟的优点:
高效:可以在同一个细胞内同时检测两种或更多种细胞因子,也可根据细胞免疫表型区分分泌细胞因子的细胞的亚型,进行多参数相关分析;
简便:可以用全血分析,也可以使用分离的PBMCs;
适用性广泛:可以使用新鲜的样品,也可以使用冻存的样品。
二、常用的标本类型和处理方法
1)全血:使用肝素钠抗凝的真空采血管采血,不建议采用肝素锂和EDTA抗凝剂,血样在8小时内分析,超过8小时会导致活性的损失,一般细胞因子阳性细胞会减少。
2)外周血单个核细胞(PBMCs):使用肝素钠/枸橼酸钠抗凝的采血后,分离PBMCs,使用新鲜细胞进行分析或者采用合适的冻存液将细胞在-70℃或者液氮冻存,复苏后进行试验。
3)细胞系与T细胞克隆:调节细胞浓度至1-2×106个细胞/mL于新鲜培养基中。
4)冰冻全血:使用1×红细胞裂解液处理活化的外周血,用PBS漂洗,并用合适的冻存液重悬,-70℃或者液氮冻存。
三、实验流程
对于临床研究项目,因试验中心与检测实验室距离较远,所以常用的样本类型为冻存的PBMC细胞。下面以PBMC为例,简要介绍一下实验流程,如下图1所示。
1)新鲜分离或者冻存的PBMC细胞经复苏,计数后转入合适的微孔板中;
2)如果是冻存的PBMC细胞,可以让细胞静置培养过夜;
3)加入刺激剂,刺激细胞因子的产生。刺激剂根据不同的实验目的的不同,可以选用的刺激剂也不同,比如PMA+ Ionomycin,SEB,LPS,PHA and Ionomycin,CD3+CD28抗体,以及特异性的相关抗原蛋白等。刺激的时间,根据研究目的和检测细胞因子的不同,刺激的时间从几个小时到几天都有可能;
4)因为细胞因子在细胞内产生后,正常情况下会分泌到细胞外,加入Brefeldin A (BFA)、Monensin阻断胞内高尔基体介导的转运的方法使得细胞因子聚集,蓄积;
5)进行细胞表面染色;
6)固定,破膜;
7)进行细胞内标志物的染色;
8)流式细胞仪进行分析。
图1 以PBMC为例,胞内因子检测的主要实验流程
四、数据分析
基于不同的实验目的,数据分析的设门策略可能会有所不同,总体的原则是先利用物理参数FSC与SSC进行设门,然后利用表面的标志物进行细胞亚群的分析,最后利用细胞内标志物进行进一步区分。
图2 利用FlowJo 进行数据分析设门策略的示例
Intracellular cytokine production by T cells (IFN-, TNF, IL-2, IL-17, IL-22). The first three plots in each row show gating hierarchy for CD4+ and CD8+ T cells. The next panel of subsequent three plots shows cytokine production by CD4+ T cells and the final panel shows the same for CD8+ T cells. (A) unstimulated (B) PMA and Ionomycin stimulation (C) PHA and Ionomycin stimulation (D) anti CD3/CD28 stimulation.
图3 不同的刺激条件引起T细胞产生IFN-, TNF, IL-2, IL-17, IL-22的比较
五、应用
细胞内细胞因子的检测在很多领域有着广泛的应用。举例如下:
1)细胞亚群的分析:根据Th细胞分泌特异性细胞因子的特点,通过对细胞胞内因子的检测,判定Th细胞亚群,检测绝对数量和相对占比。
2)功能性受体占位:对于某些在PBMC细胞表达非常弱的靶点,很难采用常规的受体占位方法进行检测,可以采用功能性受体占位的方法,采集给药后的受试者全血或者PBMC细胞,经体外刺激后,受体占位水平不同的样本,胞内细胞因子产生的量或者胞内因子阳性的细胞比例与受体占位水平正相关,可以用于评价受体占位水平。
3)细胞免疫功能检测:某些疾病状态下,比如HIV感染,HIV的独特性在于可选择性地作用于宿主CD4+ T细胞,使之大量耗竭。用多参数流式检测CD4+T细胞产生的细胞因子可以反映CD4+T细胞的免疫功能。或者HBV感染,经治疗后,患者的免疫功能逐步恢复,通过测定患者PBMC对于HBV抗原多肽的反应,可反应患者的治疗效果。
4)疫苗免疫效果评价。疫苗接种后,用多参数流式检测胞内因子可以反应疫苗刺激后诱导的T细胞免疫应答的强弱,可以用于评价疫苗免疫的效果。与检测接种疫苗后血清中的抗体水平,互为补充,更全面的评价疫苗免疫的效果。
参考文献
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