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2020年11月10日

使用LBA分析方法进行大分子生物标志物的定量检测分析

2020-11-10 14:35:04 来源:互联网 阅读:-

随着医药产业的快速发展,产品研发效率和安全性越来越成为医药研发中关注的重点,很多传统药企和新兴的生物技术公司往往会在药物研发过程中使用生物标志物以加速药物研发进程和确保产品安全性。在对生物标志物的检测上,使用商业化的试剂盒可以说是目前大部分企业的首选。

商业化试剂盒的优势和局限

商业化试剂盒为生物标志物提供了一种操作简易、移植性强、高效便捷的快速检测方案。相比较开发一个全新的方法用于生物标志物的检测,直接使用商业化的试剂盒可以大大地缩短生物分析方法建立的时间,减少方法建立所需的资源。目前商业化试剂盒的生产商也往往会基于用户的需求对其产品进行开发分类,例如R&D Systems的ELISA试剂盒,有开发度较高的Quantikine系列,也有性价比和灵活度更高的DuoSet系列;又例如MSD的细胞因子试剂盒,有V-PLEX、R-PLEX、U-PLEX等系列,各具特点和适用范围,这些生产商基于用户需求而进行的个性化产品开发,也大大增加了我们选择的自由度。

使用商业化试剂盒往往也会遇到一些限制。首先,从产品设计上来说,商业化试剂盒并不是为了某个特定的临床项目而进行设计的,因此对于一个特定的临床项目来说,使用商业化试剂盒是否合适或者说选择哪个商业化的试剂盒就需要进行额外的评估。其次,从开发程度上来说,虽然商业化试剂盒在研发过程中有内部的考察项和合格标准,但不同的生产商对试剂盒的标准相差甚远,不同类别的试剂盒也有其不同的校验体系,因此不同供应商的产品在稳定性和重现性上也差别较大,在实际的生物分析方法中需要进行确认。最后,从分析方法验证的角度上来说,需要对分析方法进行特定的验证项的考察,这些验证通常是试剂盒生产商并未在产品开发中进行过的,或者进行的标准和方式不太适用。所以总的来说,不管选用哪个厂家的何种试剂盒,在进行生物样本检测之前,都需要进行进一步的方法参数确认和调整。

试剂盒确认测试

在设计进行试剂盒的测试时,首选需要明确的是生物标志物数据的用途。下述是对于关键性的生物标志物所选用的试剂盒的测试建议,对于非关键的生物标志物,例如内部分析、生物标志物筛选等,可以根据实际需求进行设计。

标准曲线和样品浓度测试

该测试包括一条标准曲线和多个实际的生物样本,可以参照试剂盒说明书进行初步的设计,选择合适的标准曲线点和生物分析样本的稀释倍数。对于有些试剂盒,提供的标准曲线点数可能较少,可以根据实际需要进行延展测试。也可在本测试中加入三到五个水平配制的QC(在试剂盒的稀释液或基质中),初步判断测试结果的稳定度。

对于标准曲线的拟合,一般情况下,可以先参考试剂盒供应商的建议。由于可能会对试剂盒原始的标准曲线点进行更改,所以我们主要还是根据实际的测试结果对不同的参数和权重因子进行对比,选择合适的拟合模型。

通过这个测试,我们可以基本确定方法大致的表现情况、方法的定量范围及从标准曲线上得到的检测灵敏度、标准曲线回归模型以及样本大概的浓度范围。

平行性和选择性测试

在平行度测试中可使用至少三个(建议6个)包含内源性生物标志物的测试样品,在不同的稀释度下进行测定。在样本的选择上,建议尽可能选择浓度较高(但不应高于标准曲线上限)并有梯度分布的样本进行测试。在对样本进行稀释时,应尽可能稀释至标准曲线定量范围外以得到更多的数据用于参考。平行性可以证明标准品与内源性分析物在免疫学上的相似性,以及使用替代基质的有效性。

对于选择性测试,建议使用平行性测试中相同的生物样品进行。向样品中加入标准品,建议对不同的样品加入不同浓度的标准品,计算标准品的回收率。通过平行性和选择性的测试,我们可以确定方法的基质效应,并选择合适的MRD。

QC定值

在本测试中,建议选择2个以上的个体基质进行质控样本的配制并优先选用纯基质作为质控。可以根据方法在前述测试中的表现和实际的需求进行质控样品目标浓度的选择,再根据平行度和选择性结果确定质控的配制方式,由于标准曲线在ULOQ和LLOQ附近的变异度较大,对于LLOQ和ULOQ的目标质控样品建议进行多个不同的配制,以得到合适的质控浓度。

QC定值测试建议进行至少3次,在这个测试中,我们能够得到质控的配制方式及其浓度的参考值,并且也能对方法的精密度、重现性、稳定性进行评估。

额外的考虑

由于使用试剂盒进行检测本身的特性,以下几点问题也需要进行额外的考虑。

高浓度标准品的可得性

由于很多试剂盒提供的标准品浓度较低,所以在实际中往往需要额外的高浓度的标准品用于配制高浓度的验证样品(例如稀释线性样品)和质控样品,所以在使用商业化试剂盒时,最好是和供应商确定高浓度标准品的可得性,提前采购。

试剂的可替代性

底物溶液、终止液、洗液等试剂可以被实验室中常用的试剂替代。在进行更改之前,应通过分析验证来评估这些试剂的可替代性。例如使用1×PBST作为洗液替代试剂盒中提供的洗液。

关键试剂的批量化

如果采用自动化方法,则应提前和供应商确定是否可以采购大批量的关键试剂,例如抗体偶联物。自动化过程也必须包括在测试过程中并经过验证。

特异性确认

对于检测的特异性,通常试剂盒供应商会在产品开发中进行过测试,说明书上也会有说明。如果试剂盒中没有相关的说明,需要和供应商进行确认,必要时可以进行特异性的确证。

批间差

在实际分析中经常会遇到试剂盒批次更换的情况,在前期测试中,最好是能采购不同批次的试剂盒进行批次间对比以确定批次间的差异。如果可能的话,对于同一个项目,最好是单个批次采购大量试剂盒或关键试剂(如标准品和抗体偶联物)以满足所有样本的检测。不过大部分的情况下,项目持续时间往往很长,使用多个批次的试剂盒通常是不可避免的。尽管试剂盒供应商在控制生产过程中扮演着重要的角色,以限制批次之间的变化,但是作为用户,我们也需要制定一个流程来监测批次变化之间的性能一致性。

试剂盒有效日期的管理

通常来说,试剂盒中的试剂很少在过期后马上失效。由于试剂盒费用较高,建议定义一个延长试剂盒过期日期的程序,以减少试剂盒采购的成本,尤其是对于需要大量试剂盒来支持的研究。



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